生物標志物是指能被客觀測定及評估的，包括正常生理進程、致病過程及介入治療后藥理學響應的特征性指標，如脈搏、體溫、血壓、內(nèi)源性化合物等。其中內(nèi)源性化合物可以是小分子化合物( 如部分有機酸、激素等) ，也可以是大分子化合物( 如 DNA/ＲNA、蛋白質(zhì)等) 。這類化合物在基礎(chǔ)環(huán)境中以特定的濃度存在，當有干擾時，其濃度水平可能發(fā)生改變。它們可能是涉及信號通路、酶促反應鏈( 如代謝途徑) 的某些物質(zhì)。
 

通常情況下，生物標志物在體內(nèi)的濃度是其形成和消除達到動態(tài)平衡時的結(jié)果。通過對某些內(nèi)源性生物標志物的測定，可獲知機體當前所處的生理學狀態(tài)，這對于某些相關(guān)疾病的診斷、預防及治療過程具有監(jiān)控與輔助等作用。目前，尋找及發(fā)現(xiàn)有價值的生物標志物已經(jīng)成為生物學研究的重要熱點之一。基質(zhì)效應是由與分析物共流出的其他內(nèi)源性物質(zhì)( 例如鹽類、胺類、脂肪酸、甘油酸酯等) 造成的影響或干擾。這些物質(zhì)與分析物共流出至噴霧針可能會影響待分析物的霧化、揮發(fā)、裂分、化學反應及帶電過程，導致進入質(zhì)譜的離子減少( 離子抑制) 或增多( 離子增強) ，從而影響定量結(jié)果的可靠性和準確性?，F(xiàn)

階段 LC － MS /MS 法定量測定內(nèi)源性物質(zhì)存在兩大難點，一方面由于未知量的內(nèi)源性物質(zhì)已在基質(zhì)中存在，導致了定量過程中空白基質(zhì)難以獲取; 另一方面，由于 一 些 內(nèi) 源 性 物 質(zhì) 含 量 極 低，有 些 甚 至 低 于LC － MS方法的定量下限。為解決這兩方面難題，科學家們作出很多努力。

近年來檢測生物樣品內(nèi)源性成分的定量方法，包括背景差減法、標準加入法、替代基質(zhì)法及替代待測物法，同時對含量較低的內(nèi)源性成分進行測定時所用的化學衍生化-LC － MS 法進行介紹，并通過研究實例加以闡述，以期為 LC － MS /MS 法檢測內(nèi)源性成分提供參考。

 

1 內(nèi)源性成分測定的方法

內(nèi)源性成分物質(zhì)檢測中存在的最常見的難點是基質(zhì)效應的考察，目前較常使用的方法主要有背景差減法、標準加入法、替代基質(zhì)法及替代待測物法。
 

1． 1 背景差減法 背景差減法
是指從所添加標準品的濃度中減去基質(zhì)中分析物的內(nèi)源性背景濃度，隨后使用相減的濃度來建立標準曲線。該方法中，分析物及標準曲線具有相同的基質(zhì)，因此兩者具有相同的回收率及基質(zhì)效應。但為保證方法的重復性，在基質(zhì)中添加已知濃度標準品后引起峰面積增大的幅度比未添加前的峰面積應滿足方法中對重復性的限度要求( 如 15% ～ 20% ) 。因此，方法的定量下限( LLOQ)是由用于繪制標準曲線所用批次基質(zhì)中的內(nèi)源性分析物濃度決定的，有別于傳統(tǒng)意義上的 LLOQ 是由MS 信噪比為 10 時的濃度。但在實際運用中，若方法所需的 LLOQ 比基質(zhì)中內(nèi)源性分析物的濃度要低，可在加入標準品之前對基質(zhì)進行稀釋，而后加入較低濃度的對照品進行實驗。但如此操作后就意味著待測樣品與繪制標準曲線的基質(zhì)存在差異，所以需要對基質(zhì)稀釋前后的提取回收率進行考察對比。另一方面，加入基質(zhì)的標準品濃度較低時，可能會引起樣品的不穩(wěn)定。當加入的 2 － 花生基甘

油醚及血栓素 B2 質(zhì)控( QC) 樣品的濃度為 1． 3 ng /ml時，日內(nèi)變異系數(shù)( CV) ＞40%，當加入濃度為 20 ng /ml時 CV 均 ＜20%。
 

1． 2 標準加入法 標準加入法的應用主要分為兩類: 一類是制備不含分析物的空白基質(zhì)，前提是基質(zhì)中所含分析物的濃度非常低( 一般在 LLOQ 的 20% 以下) ，也可通過某些方式( 如活性炭吸附等) 使得空白基質(zhì)內(nèi)的分析物濃度達到預設(shè)要求。另一類是在相同基質(zhì)中加入分析物從而計算出內(nèi)源性化合物的濃

度。

1． 3 替代分析物法替代分析物研究中，由穩(wěn)定同位素標記物作為分析物替代物參與標準曲線的建立及定量的過程。因該方法的基質(zhì)中缺少內(nèi)源性成分的干擾，故可對替代分析物進行直接且靈敏的定量。另外，同位素標記物與分析物除分子量有差異外，假定其余理化性質(zhì)均類似，因此它們具有相同或者類

似的提取回收率、色譜保留行為及信號響應。但是實際研究中發(fā)現(xiàn)，同位素對照品與未標記分析物通常在保留時間及 MS 靈敏度方面略有差異。因此在實驗前，必須對標記物及未標記物的 MS 信號響應比值進行測定，其值需在整個校正范圍內(nèi)接近一致。若 ＲF 不為常數(shù)，則需在校正曲線的回歸方程中進行體現(xiàn)。
 

2 小 結(jié)

內(nèi)源性生物標志物在現(xiàn)代醫(yī)療中擔負著越來越重要的角色，故對其檢測方法的研究也逐漸凸顯出份量，內(nèi)源性生物標志物的成功定量將對“精準醫(yī)療”的發(fā)展產(chǎn)生積極的促進作用。采用合適的樣品前處理方法及合適的測定方法對方法學的建立及良好的驗證產(chǎn)生具有重大意義。但本文所述方法均為非直接測定內(nèi)源性物質(zhì)含量的方法，故必須對這類方法進行較為系統(tǒng)的驗證。由于目前暫時未有公認、詳盡的驗證標準和原則，故亟待通過科學家的共同努力，促進該研究方向的發(fā)展。